研究内容

① トロンボモジュリン変異体を用いた移植後合併症予防薬の開発
池添隆之他
【背景】
 血管内皮細胞上に存在するトロンボモジュリン(TM)は、複数の領域から構成され、血液凝固線溶系を制御する重要な蛋白質です。遺伝子組み換えTM製剤はTMの細胞外領域よりなり、2008年5月からDIC(播種性血管内凝固症候群)治療薬として広く臨床使用されています。わたしたちは、豊富な本剤の使用経験の中から造血幹細胞移植後の重篤な合併症を基礎疾患として発症したDIC患者において著効例を経験し、本剤は抗凝固作用以外に血管内皮保護作用を有することを世界で初めて見出して報告しました(Bone Marrow Transplant. 46:616-8;2011, Bone Marrow Transplant. 45:783-5;2010)。培養細胞を用いた試験管内実験の結果、TM製剤が細胞増殖刺激シグナルERKの活性化を介して抗アポトーシス蛋白質Mcl-1を発現誘導して血管内皮細胞を保護すること、そしてその活性は上皮細胞増殖因子(EGF)様構造の4番目と5番目(TME45)に存在することを明らかにしました(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32:2259-70,2012)。さらにその後の研究で内皮細胞保護作用は40アミノ酸からなる凝固系に全く作用しないTME5に局在することを発表しました(Bone Marrow Transplant. 52:73-9;2017)。
【目的】
 これまでTMがどのように細胞生存シグナルを内皮細胞内に伝達するのか知られていませんでした。わたしたちはTME5と反応する血管内皮細胞の膜蛋白を免疫沈降法で沈殿後、蛋白質量解析を行い、TMがケモカイン受容体GPR15を介してその機能を発揮することを見出しました(Pan B, Sci Rep 2017)。今後TME5が内皮細胞を保護する作用機序の解明と、TME5を用いた新たな血管内皮細胞保護薬の開発を目指して研究を行う予定です。

 

最近の論文

1. Pan B, Wang X, Nishioka C, Honda G, Yokoyama A, Zeng L, Xu K, Ikezoe T. G-protein coupled receptor 15 mediates angiogenesis and cytoprotective dunction of thrombomodulin. Sci Rep. 7(1):692. doi:10.1038/s41598-017-00781-w, 2017
2. Pan B, Wang X, Kojima S, Nishioka C, Yokoyama A, Honda G, Xu K, Ikezoe T. The fifth epidermal growth dactor-like region of thrombomodulin alleviates murine graft- versus-host disease in a G-Protein Coupled Receptor 15 Dependent Manner. Biol Blood Marrow Transplant. 23(5):746-756, 2017
3. Pan B, Wang X, Kojima S, Nishioka C, Yokoyama A, Honda G, Xu K, Ikezoe T. The fifth epidermal growth factor like region of thrombomodulin alleviates LPS-induced sepsis through interacting with GPR15. Thromb Haemost. 117(3):570-579, 2017
4. Ikezoe T, Yang J, Nishioka C, Umezawa K, Yokoyama A. Thrombomodulin blocks calcineurin inhibitor-induced vascular permeability via inhibition of Src/VE-cadherin axis. Bone Marrow Transplant. 52(2):245-251, 2017
5. Chi S, Ikezoe T. Disseminated intravascular coagulation in non-Hodgkin lymphoma. Int J Hematol. 102:413-419, 2015
6. Ikezoe T. Thrombomodulin/activated protein C system in septic disseminated intravascular coagulation. J Intensive Care. 7;3(1):1. doi: 10.1186/s40560-014-0050-7, 2015
7. Ikezoe T, Yang J, Nishioka C, Yokoyama A. Thrombomodulin alleviates murine GVHD in association with an increase in the proportion of regulatory T cells in the spleen. Bone Marrow Transplant. 50:113-20, 2015
8. Ikezoe T. Pathogenesis of disseminated intravascular coagulation in patients with acute promyelocytic leukemia, and its treatment using recombinant human soluble thrombomodulin. Int J Hematol. 100:27-37, 2014
9. Chi S, Ikezoe T, Takeuchi A, Takaoka M, Yokoyama A. Recombinant human soluble thrombomodulin is active against hemophagocytic lymphohistiocytosis associated with acquired immunodeficiency syndrome. Int J Hematol. 98:615-9, 2013
10. Ikezoe T, Takeuchi A, Chi S, Takaoka M, Anabuki K, Kim T, Sakai M, Taniguchi A, Togitani K, Yokoyama A. Effect of recombinant human soluble thrombomodulin on clinical outcomes of patients with coagulopathy after hematopoietic stem cell transplantation. Eur J Haematol. 91:442-7, 2013

② 急性白血病新規治療標的分子の探索
池添隆之他
a) 分裂期キナーゼを標的とした治療
急性骨髄性白血病をはじめとする血液がんの治療成績は造血幹細胞移植の導入で改善したとはいえ未だ満足できるものではありません。移植後再発例も後を絶たず、通常の抗がん剤治療や移植免疫だけでは白血病細胞の根絶は難しいと考えられます。私たちは急性白血病で新たに治療標的となる分子を見出す研究を行っております。これまでに急性白血病や悪性リンパ腫で、細胞周期の分裂期を制御するオーロラキナーゼやポロライクキナーゼなどの分裂期キナーゼに機能異常があり、治療標的となりうることを報告してきました(Blood. 110:2034-40,2007 Leukemia. 23:1564-76,2009)。現在各製薬会社からこれらに対するキナーゼ阻害剤が作成されその有効性が臨床試験で検討されています。

b) CD82を標的とした治療
急性骨髄性白血病細胞の表面抗原CD34陽性かつCD38陰性細胞分画には抗がん剤治療に抵抗性を示す白血病幹細胞が濃縮されていると考えられています。私たちはこの細胞集団がテトラスパニンファリーCD82をその細胞表面に豊富に発現することを見出しました(Int J Cancer. 132:2006-19,2013)。このCD82は白血病細胞内のさまざまなシグナル伝達経路を活性化して抗アポトーシス蛋白の発現を上昇させ、抗がん剤治療に抵抗性を獲得する原因分子となっていることを見出しました。実際に白血病細胞表面のCD82を中和抗体で阻害すると抗がん剤シタラビンへの感受性が増強することをヒト化白血病マウスモデルを用いた実験で示しました。今後さらにCD82の機能解析を進め、CD82あるいはその下流シグナルを標的とした治療法の臨床開発を進めていく予定です。anti-CD82 antibody

 

最近の論文
1. Nishioka C, Ikezoe T, Takeuchi A, Nobumoto A, Tsuda M, Yokoyama A. The novel function of CD82 and its impact on BCL2L12 via AKT/STAT5 signal pathway in acute myelogenous leukemia cells. Leukemia. 2015;29:2296-306.
2. Nishioka C, Ikezoe T, Yokoyama A. Blockade of CD82 by a monoclonal antibody potentiates anti-leukemia effects of AraC in vivo. Cancer Med. 2015;4:1426-31.
3. Nishioka C, Ikezoe T, Yang J, Yokoyama A. Tetraspanin Family Member, CD82, Regulates Expression of EZH2 via Inactivation of p38 MAPK Signaling in Leukemia Cells. PLoS One. 2015;10:e0125017.
4. Takeuchi A, Nishioka C, Ikezoe T, Yang J, Yokoyama A. STAT5A regulates DNMT3A in CD34(+)/CD38(-) AML cells. Leuk Res. 2015;39:897-905.
5. Nishioka C, Ikezoe T, Yang J, Nobumoto A, Kataoka S, Tsuda M, Udaka K, Yokoyama A. CD82 regulates STAT5/IL-10 and supports survival of acute myelogenous leukemia cells. Int J Cancer. 2014;134:55-64.
6. Yang J, Ikezoe T, Nishioka C, Udaka K, Yokoyama A. Bcr-Abl activates AURKA and AURKB in chronic myeloid leukemia cells via AKT signaling. Int J Cancer. 2014;134:1183-94.
7. Yang J, Ikezoe T, Nishioka C, Nobumoto A, Udaka K, Yokoyama A. CD34⁺/CD38⁻ acute myelogenous leukemia cells aberrantly express Aurora kinase A. Int J Cancer. 2013 Dec 1;133(11):2706-19.

③ 多発性骨髄腫細胞と骨髄間質細胞間におけるgrowth arrest-specific 6(Gas6)が寄与するオートクライン・
 パラクライン機構の解明
大河原浩他
【研究目的】
 多発性骨髄腫は多彩な単クローン性免疫グロブリン(M蛋白)および骨髄腫細胞と骨髄の間質細胞の細胞間相互作用によって産生されるサイトカインなどの液性因子によって多彩な臨床症状を呈する疾患であり、その病態には未だ多くの不明点があります。プロテインCの補因子として知られるGas蛋白群の一員であるGas6(growth arrest-specific 6)は受容体型チロシンキナーゼ(Tyro3, Axl, Mer)のレガンドであり、自己免疫疾患や炎症病態への関与が報告されています(Cell. 54:787-793, 1988 PLos One. 10:e0133940, 2015 J Cell Physiol. 204:36-41, 2005)。本学トランスレーショナルリサーチセンターでのDNAマイクロアレイの結果にて、多発性骨髄腫患者の骨髄サンプルでGas6が著明に高発現していることが見出されました。骨髄腫患者の骨髄免疫染色においても、骨髄腫細胞を示すCD138陽性細胞がGas6強陽性を示し、骨髄患者の血清Gas6濃度も有意に増加していました。我々はいくつかのヒト培養骨髄腫細胞においてもGas6を高発現していることをフローサイトメトリーで確認しました。しかしながら骨髄腫の病態にGas6シグナルが寄与する詳細なメカニズムは未だ明らかではありません。骨髄腫細胞は骨髄微少環境に左右され多彩な病態を来たします(Haematologica. 99:163-171, 2014)。また、我々は骨髄腫細胞自体がGas6を高発現するだけでなく、骨髄間質細胞がGas6を産生することを見出しました。骨髄間質細胞が分泌するGas6を介したパラクライン作用が骨髄腫細胞の増殖を増強している可能性が示唆されました。これらの結果は骨髄腫の病態にGas6を介したオートクライン/パラクライン機構が重要な役割を持つ可能性を示唆すると考えられます。本研究は骨髄腫の病態・進展の分子機構の一端を明らかにするとともに、Gas6が骨髄腫の病勢を反映するバイオマーカーであることを明らかにすることを目的としています。
【研究成果】
 多発性骨髄腫患者の骨髄サンプルを用いたDNAマイクロアレイ法及びGas6免疫染色を行ったところ、CD138陽性骨髄腫細胞でGas6が高発現していました。さらに、多発性骨髄腫患者の血清中Gas6濃度をELISA法にて検討したところ、健常人に比べ骨髄腫患者の血清中Gas6濃度は有意に高値でした。ヒト培養骨髄腫細胞株RPMI-8226及びAMO-1においてGas6発現をフローサイトメトリー法で検討したところ、それら骨髄腫細胞株もまたGas6を高発現していました。また、骨髄腫細胞の病態・進展には骨髄微少環境が重要であることが知られています。そこで、ヒト培養骨髄間質細胞株HS-5のGas6発現、細胞増殖に関与するサイトカインIL-6発現をELISA法で検討したところ、HS-5はGas6及びIL-6を有意に分泌していることが分かりました。次に骨髄腫細胞のアポトーシス及び細胞増殖におけるGas6の役割を検討しました。骨髄腫細胞株にリコンビナントGas6及びHS-5の培養上清を添加したところ、骨髄腫細胞株のアポトーシス抑制と細胞増殖、接着分子ICAM-1発現増加が誘導されました。抗Gas6中和抗体はそれらの反応を有意に抑制し、さらに抗Gas6中和抗体はリコンビナントGas6及びHS-5培養上清によって誘導されるERK活性、Aktリン酸化、NF-κBリン酸化を抑制しました。これらの結果はGas6がオートクライン・パラクライン機構を介した骨髄腫の病態・進展に重要な役割を演じていることを示しました。次にGas6受容体TAMファミリーMer、AxL、Tyro3のいずれの受容体がGas6の関連するシグナル伝達に重要な受容体であるかを検討しました。DNAマイクロアレイ法では骨髄腫患者の骨髄腫細胞がMerが高発現していることを示しました。MerTK siRNAを用いたMerTK阻害は骨髄腫細胞におけるGas6及びHS-5培養上清が誘導するアポトーシス抑制及び細胞増殖を抑えました。これらの結果はGas6/Mer/ERK経路、Gas6/Mer/Akt/NF-κB経路が骨髄腫の病態・進展に重要なメカニズムであることを明らかにしました。骨髄腫細胞の増殖に接着分子ICAM-1が重要であることが知られていますが、骨髄腫細胞株において抗Gas6中和抗体はHS-5培養上清が誘導するICAM-1発現及びサイトカインIL-6発現増加を抑えました。
本研究は多発性骨髄腫の病態においてGas6が寄与するオーグライン/パラクライン機構の重要性を明らかにしました。さらに、Gas6/Merシグナル伝達経路が多発性骨髄腫の新たな治療ターゲットとなる可能性を見出しました。


④ 同種造血幹細胞移植関連GVHD及びTMAにおけるGas6/MerTKシグナルの役割
【研究目的】
 同種造血幹細胞移植(allo-HSCT)は造血器悪性腫瘍や造血障害における唯一の根治治療法です。しかし、移植片対宿主病(GVHD)や血栓性微小血管障害症(TMA)、免疫不全に伴う感染症、原疾患の再発等により治療成績は十分ではありません。我々はプロテインC補因子でありながら受容体型チロシンキナーゼのリガンドであるgrowth arrest-specific gene 6(Gas6)が多発性骨髄腫の病態・進展に重要な役割を担うことを報告しました(Furukawa M, et al. J Biol Chem. 292:4280-4292, 2017)。
これまでの予備実験で、血清Gas6濃度がallo-HSCT後3-5週をピークに患者体内で高値となることを見出しました(図2)。allo-HSCT後にドナー由来リンパ球による攻撃を受けたことで生じる血管内皮細胞障害がGVHD及びTMAを惹起する可能性が示唆されています。培養ヒト血管内皮細胞を用いた我々のin vitro予備実験では、rGas6が抗凝固因子トロンボモジュリン発現低下及びAktリン酸化を介した内皮型一酸化窒素(NO)合成酵素活性低下(NO障害)を誘導する可能性を見出しました。さらに、我々はrGas6が血小板凝集能を亢進させ、血小板血栓の形成を誘導する結果を得ています。これまでGVHD及びTMAの発症トリガーとなる内皮細胞障害や免疫学的バランス破綻が寄与する病態において、Gas6関連シグナルの関連性は検討されておりません。本研究はGVHD及びTMAの病態におけるGas6関連シグナルの役割を解明し、Gas6関連シグナルがGVHD及びTMAにおける新たな治療戦略候補となり得ることを明らかにします。



【研究成果】
 ・同種移植後の患者血清のGas6濃度は移植後3-5週をピークに増加していた。
 ・同種移植後の血清Gas6はフローサイトメトリーでドナーTリンパ球及びドナー単球由来であることが
  明らかになった。
 ・免疫染色でGas6及びMerTKは腸管GVHD組織で高発現していた。
 ・ヒト静脈血管内皮細胞を用いたin vitro実験で、rGas6刺激は内皮機能障害(eNOS発現低下、トロン
  ボモジュリン発現低下、接着分子ICAM-1発現増加)を誘導した。Gas6受容体MerTK阻害薬は
  rGas6刺激で誘導された血管内皮機能障害を有意に抑制した。
 ・ヒト静脈血管内皮細胞へrGas6及びGVHD患者血清を添加すると内皮細胞のアポトーシスが誘導され
  た。MerTK阻害薬はrGas6及びGVHD患者血清が誘導した内皮細胞のアポトーシス亢進を抑制した。
  MerTK阻害は内皮機能障害がトリガーとなって発症する血管GVHDを抑える可能性が示唆された。
 ・同種移植後の患者血清のGas6血清濃度はDダイマー増加、PIC増加と相関していた。
 ・Gas6受容体MerTK阻害薬はコラーゲン及びADPなどの血小板凝集惹起物質で誘導される血小板凝集
  亢進を著明に抑制した。
 ・ヒト静脈血管内皮細胞を用いたin vitro実験で、rGas6刺激による抗凝固因子トロンボモジュリン発現
  低下、プラスミノーゲン活性化抑制因子(PAI-1)増加を抑制した。
以上の結果から、血管内皮細胞障害を介してオーバーラップしたGVHD及びTMAの両病態において、Gas6/MerTKシグナルが重要な役割をもつ可能性が示唆されました。


学会発表・論文等
〈学会発表〉
1. Miki Furukawa, Hiroshi Ohkawara, Kazuhiko Ikeda, Emi Ito, Jun-ichi Imai, Yuka Yanagisawa, Reiko Honma, Shinya Watanabe, Satoshi Waguri, Kazuei Ogawa, Yasuchika Takeishi. Autocrine and paracrine regulation by Gas 6 contributes to multiple myeloma disease progression. 第77回 日本血液学会学術集会(2015.10.16-10.18 金沢)臨床血液 56(9):442, 2015
2. Miki Furukawa, Hiroshi Ohkawara, Kazuhiko Ikeda, Emi Ito, Jun-ichi Imai, Yuka Yanagisawa, Reiko Honma, Shinya Watanabe, Satoshi Waguri, Kazuei Ogawa, Yasuchika Takeishi. Autocrine and paracrine regulatory mechanisms of growth arrest-specific Gene 6 contribute to disease progression of multiple myeloma. 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition(2015.12.5-12.8 Orlando, USA)
3. Miki Furukawa, Hiroshi Ohkawara, Kazuhiko Ikeda, Koki Ueda, Akiko Shichishima-Nakamura, Emi Ito, Jun-ichi Imai, Yuka Yanagisawa, Reiko Honma, Shinya Watanabe, Satoshi Waguri, Kazuei Ogawa, Yasuchika Takeishi. Autocrine and paracrine interactions by Gas 6 signaling pathways via IL-6 between MM cells and BMSCs. 第78回 日本血液学会学術集会
(2016.10.13-10.15 横浜)臨床血液 57(9):1445, 2016
4. Sho Takeyasu, Hiroshi Ohkawara, Koichiro Fukuchi, Wang Xiangmin, Koki Ueda, Kazuhiko Ikeda, Kazuei Ogawa, Takayuki Ikezoe. A critical role of growth arrest-specific gene 6 in the pathogenesis of HSCT-associated thrombotic microangiopathy.第79回 日本血液学会学術集会
(2015.10.20 東京) 優秀ポスター賞受賞
〈論文〉
Miki Furukawa, Hiroshi Ohkawara, Kazuei Ogawa, Kazuhiko Ikeda, Koki Ueda, Akiko Shichishima-Nakamura, Emi Ito, Jun-ichi Imai, Yuka Yanagisawa, Reiko Honma, Shinya Watanabe, Satoshi Waguri, Takayuki Ikezoe, Yasuchika Takeishi. Autocrine and paracrine interactions between multiple myeloma cells and bone marrow stromal cells by growth arrest-specific gene 6 cross-talk with interleukin-6. J Biol Chem. 297:4280-4292, 2017
〈賞与〉
認定公益信託 日本白血病研究基金 平成29年度研究賞
福島県立医科大学 血液内科学講座 大河原 浩
GVHD及びTMAの病態におけるGas6関連シグナルの役割を解明し、Gas6関連シグナルがGVHD及びTMAにおける新たな治療戦略候補やバイオマーカーとなるえることを明らかにする