中枢神経による学習や記憶のメカニズムを明らかにするために、様々な記録手法を駆使して世界中で研究が進められています。私たちはこれまで、行動課題を学ばせたラットを用いて、海馬や線条体に慢性的に刺入した電極から神経発火を記録してきました。これらに加えて、ドパミンやセロトニンといった神経修飾物質は脳機能に重要な役割をもっています。しかしながら、こうした神経修飾物質と神経発火との関連は詳細に検証されておらず、さらに研究を発展させるためには行動課題中のラットから神経修飾物質濃度を計測する手法が不可欠でした。しかしながら本研究室では直接的かつ即時的に神経修飾物質濃度が測定できる手法を持ち合わせておりませんでした。そこでこの度、この研究室滞在支援制度を活用して、2018年12月17日～19日の3日間研究室にお邪魔し、電気化学法についてご指導いただける運びとなりました。
　滞在中にはまず電気化学法（サイクリック・ボルタンメトリー）の手法全般についての解説をしていただき、炭素電極の作成から実際に作業を体験させていただきました。直径0.007mmしかないカーボンファイバーをガラスキャピラリーに挿入して作成するという極めて微細な作業でした。次にドパミンを記録する際に用いる記録装置について、実物を見ながら解説して頂きました。現在使用されている機器はもちろんのこと、相澤先生が以前からご自身で電子回路を組まれて作製された数多くの装置を拝見し、その原理について詳しく学ばせて頂きました。そして最後に私の作成した電極を用いて、マウスからドパミンを検出しました。内側前脳束の電気刺激に伴い、側坐核からドパミンが迅速に放出される様子を観察することができました。
　現在私は、相澤先生にご指導いただいた経験をもとに、自身の研究室においても自由行動下の動物から電気化学法を導入するために準備を進めています。導入後は、従来私が実施してきている電気生理記録と組み合わせて同時実施することを目指します。最後に、ご多忙の中滞在を快く引き受けてくださり直接ご指導くださいました相澤先生、私の滞在をサポートしてくださった研究室のみなさま、さらに領域代表の小林和人先生をはじめ研究支援委員会の先生方に厚く御礼申し上げます。ありがとうございました。

※　得られた結果について解説して頂いている様子（左：相澤先生、右：鹿野）

 
　シナプスは神経活動に応じて構造や伝達効率などが変化する可塑性が知られています。知られている可塑的な変化のほとんどはポストシナプスでの受容体の数やスパインのサイズなどの変化であり、プレシナプスでの変化についてはほとんど知られていません。そこで私たちは神経活動が引き起こすプレシナプスへの影響を調べることにしました。
　われわれの研究室ではCAST KOマウスと特定の行動異常との関連性を示唆する予備データがあったのですが、CASTは脳全体に発現するため、CASTが重要となる脳領域は不明なままでした。そのための神経活動に応じたプレシナプスの変化を調べるモデルとして、この行動異常とCASTとの関係に着目しました。そこで、まずは行動の際に活性化する脳領域を特定し、その中でもとくに活性化した神経細胞と活性しなかった神経細胞を比較することにしました。そこで、特定の行動をしたマウスとしなかったマウスに分け、in situハイブリダイゼーション法によりc-FosとCASTの mRNAの発現領域を探索しました。その結果室傍視床核 (PVT) という領域がもともとCASTの発現が強く、行動群においてc-Fosの発現が増加していたため、CASTが制御する領域の候補と考えました。
　そこで、コントロールマウスと行動マウスの細胞ごとのc-FosとCASTのシグナルを数値化し、比較することにしました。単純に2つの遺伝子の発現量を2次元プロットしただけでは今一つ違いが見いだせず、統計処理に詳しいかたにご助言を得たほうがいいのではないかと考えていたところ、研究室滞在支援制度により、京都大学工学部電気電子工学科論理生命学分野の石井信先生のもとへ派遣させていただく機会を得ることが出来ました。8月の終わりだったため、盆地の京都はかなり暑いだろうと思い、思いっきり薄着で訪問したところ、訪れた研究室はPCデスクが立ち並ぶ冷房の効いた部屋だったため、真夏の京都とは思えぬ肌寒さを感じながらの三日間となりました。その中で統計処理について、石井先生の他、大羽先生らとディスカッションをしながら進めた結果、数値データを対数化しプロットし、さらに補正等の変換をすることにしました。そうすることで、初めはばらついていたデータの中から、c-FosとCASTの量についての正の相関を示す集団と、そこから外れた集団に分けることができました。今後はこの解析を基にPVTで発現しているCASTと行動制御との関連性をより詳細に調べていきたいと思います。
　最後に、ご多忙のところ訪問を受け入れてくださった石井先生の他、解析方法をレクチャーしてくださった大羽先生、色々相談に乗ってくださった浦久保先生、中江先生、Henrik先生、そして多大な支援をいただきました「適応回路シフト」領域代表の小林先生ならびに研究支援委員会の礒村先生やスタッフの方々にこの場を借りて厚く御礼申し上げます。

 
　随意性眼球運動系におけるセントラルドグマと言われるListingの法則（サッケードや滑動性眼球運動は、第一眼位からの眼球運動では、回旋成分を含まず、水平と垂直成分のみである。前庭動眼反射は、この法則の例外である）の中枢神経機構を明らかにするため、訓練したサルでDREADD法を用いて、これまでネコでの電気生理・解剖実験で詳細に明らかにした中脳・脳幹の回路の一部を選択的経路遮断し、その前後の眼球運動を計測することで、その回路の機能を機能的に証明する実験を継続して行っている。
　昨年度に引き続き、ウィルスベクターを注入したサルでの眼球運動解析実験を行ったが、本年度はCNO(clozapine-n-oxide)の代わりに、放医研の南本先生のご協力でC22bを使用した。また、本年度も、ほぼ毎週、火曜日から金曜日まで東京から京都大学に通い、訓練したサルの眼球運動計測と、新たな眼球運動の訓練を行った。現在そのデータを解析しつつ、コイルでなくカメラ画像による回旋成分解析システムを立ち上げている。これまで、随意性眼球運動系は水平・垂直の２次元の自由度からなる、と考えられてきたが、実際は、水平・垂直・回旋からなる３次元の座標軸が用いられている。そのため、回旋成分を解析する必要があるが、回旋を記録解析するためには、２個のコイルを用いたシステムが必要であるが、種々の理由からこれが困難であるため、ビデオカメラを用いた解析システムを構築した。高速赤外線カメラ（sampling 500Hz）を用いたカメラシステムによる回旋成分の解析はこれまでほとんど行われていないため、色々な問題が生じており、それを一つずつ克服しながら、解析システムを、徐々に作り上げてきた。さらに、大きな問題は、サルは虹彩紋理がヒトに比べ非常に曖昧であり、瞳孔とのズレを検知するにも、工夫が必要であり、そのため、パターンマッチングの方法をさらに精度を上げて改良を行った。
　このように、すでに訓練されたサルでの眼球運動解析システムの改良と、新しいサルに種々の眼球運動パラダイムを訓練し、ウィルスベクター投与準備を行った。
 
　平成27年度より２年間公募班員として、また平成29年度より研究室滞在支援制度により、このプロジェクトに多大なご支援をいただきまして、本当にありがとうございました。伊佐先生をはじめ、適応回路シフト領域代表の小林和人先生、研究支援委員会の先生方に厚く御礼申し上げます。

 
　私達の所属する研究室では、前部帯状回や内側前頭前野を含む内側前頭皮質の気分・情動調節機能に関する研究を行っています。これまでに、ニホンザルの内側前頭皮質腹内側部へ抑制性の頚頭外磁気低頻度反復刺激を施すことによって、日中の自発的身体活動量や、意欲の低下、社会的ひきこもりやコルチゾールレベルの上昇が引き起こされることが明らかになりました。
　今回、私達はこれらの症状の背景にあると考えられる内側前頭皮質と辺縁系領域を結ぶ回路、特に内側前頭皮質と強い結合関係を持つことで知られる扁桃体と側坐核に着目し、内側前頭皮質とこれらの領域の詳細な解剖学的結合関係を明らかにすることを目的として、本研究室滞在支援のもと、京都大学霊長類研究所の高田明彦先生の研究室に滞在し、逆行性二重トレーシング実験を行うとともに、その手法について学びました。井上謙一先生の作成されたAAVベクターを用いることで、標的とした領域においてとてもはっきりと神経細胞の蛍光ラベルを得ることができ、現在その解析を進めています。滞在中は、注入座標やトレーサーの注入量などの実験条件の設定、標的部位へのAAVベクターの注入実験、そして標本作成に至るまで細部にわたりご指導いただきました。染色結果の細かい解釈についても親身になって教えて頂き大変勉強になりました。今回の経験をもとに、所属研究室においても同様の実験を行えるように準備を進めています。
　最後に、この度は数度に及ぶ滞在にもかかわらず快く引き受けてくださった高田先生並びに井上先生、様々な実験手技を多忙な時間を割いて教えてくださった田辺さん、木村さん、並びに研究室の皆様、そしてこのような機会を与えてくださった本領域の皆様に心より御礼申し上げます。

＊実験風景（写真　手前：森谷、中：木村さん、奥：吉野）

J Neurosci. Methods 311: 147-155 (2019) doi: 10.1016/j.jneumeth.2018.10.023.
 

【要点】
(1) 解剖学的な神経ネットワーク研究への応用と様々な分子遺伝学的ツールとの組み合わせによる脳機能マッピングへの発展が見込まれる。
(2) パーキンソン病をはじめとする、難治性神経変性疾患に対する新たな遺伝子治療へのアプローチが期待される。
 

【研究概要】
　神経回路における情報の処理と行動機能の関係を明らかにするためには、その回路を構成するニューロンや神経路がどのような制御を受けて特定の入出力関係における神経機能をコントロールしているかを知る必要があります。我々のグループはこれまで、独自に開発した融合糖タンパク質を用いてレンチウイルスベクターをシュードタイプ化することにより、高頻度な逆行性遺伝子導入するベクター技術を開発してきました（Kato et al, J. Neuosci. 2011; Hum. Gene Ther. 2011a,b; J. Nuerosci. Methods 2014）。
　今回の研究では、融合糖タンパク質E型 (FuG-E) の特定部位に様々なアミノ酸の点変異を導入し、マウス脳内における遺伝子導入効率を解析しました。FuG-Eの440番目のアミノ酸をプロリンからグルタミン酸に置換した変異体FuG-E (P440E)が従来のベクターよりもより高い遺伝子導入効率を示すことを発見しました。この改良型ベクターは、マーモセットの脳内においても従来型ベクターに比較してより高い遺伝子導入性能を示しました。今後、解剖学的な神経ネットワーク研究への応用や分子遺伝学との組み合わせによる脳機能マッピングへの発展が望まれるだけでなく、難治性神経変性疾患に対する新たな遺伝子治療法へのアプローチとしても期待されます。

日程：　2018年12月15日(土) 13：00-16：35
会場：　一橋講堂（学術総合センター2F）
東京都千代田区一ツ橋2-1-2

参加申し込み：2018年11月30日まで（参加申込みはこちら）

第１部：行動を制御する神経回路
座長：藤山文乃・礒村宜和

13:15-13:45　小鳥の歌から学ぶ（渡邉大・京都大学）

13:45-14:15　社会性の樹立と維持を支えるホルモンの働き（小川園子・筑波大学）

14:15-14:30 休憩

第２部：精神機能を調節する神経回路
座長：尾上浩隆・相澤秀紀

14:30-15:00　経頭蓋磁気刺激によるサル精神疾患モデル（筒井健一郎・東北大学）

15:00-15:30　精神障害の神経回路病態解明を目指して（尾崎紀夫先生・名古屋大学）

第３部：機能回復を実現する神経回路
座長：伊佐正・小池康晴

15:30-16:00　脳出血モデルにおける機能回復（飛田秀樹・名古屋市立大学）

16:00-16:30　ニューロリハビリテーションの実際（道免和久・兵庫医科大）

16:30-16:35　おわりに（藤山文乃）

主催　　　　　文部科学省科学研究費補助金 新学術領域研究
行動適応を担う脳神経回路の機能シフト機構 （略称:適応回路シフト）

HP　　　　　　http://www.fmu.ac.jp/acs

問い合わせ先　新学術領域研究「適応回路シフト」事務局
福島県立医科大学医学部生体機能研究部門内

e-mail: 　　　acs@fmu.ac.jp TEL: 024-547-1668

※ 領域関係者およびその教室員に対象を限定した、クローズドな会議です。

 
日時：　２０１８年１２月１４日（金）－１５日（土）
　　　　　　1日目　9：00 – 19：10 (口頭発表)
　　　　　　2日目　9：00 – 11：45（口頭発表）
　　　　　　詳細な日程につきましては、確定し次第、本記事にてお伝えいたします。

 
場所：　学術総合センター1階　会議室　（東京都千代田区一ツ橋２－１－１）

 
事務局: 福島県立医科大学・医学部・生体機能研究部門
　　　　新学術領域研究 「行動適応を担う脳神経回路の機能シフト機構」(適応回路シフト)
　　　　福島県福島市光が丘1番地

 
電話:　024-547-1668
ファックス:　024-548-3936

 
電子メール:acs@fmu.ac.jp

 
URL: http://www.fmu.ac.jp/acs/